"Este es un hallazgo sin precedentes e inesperado", han dicho Helen Blau, PhD, E. y Delia B. Baxter profesora y directora de Donald del laboratorio de Baxter en farmacología genética. "Estamos consiguiendo indicios que esto pudiera ser biológicamente importante, pero todavía tenemos mucho que aprender". La investigación, conducida por Clas Johansson, PhD, erudito postdoctoral del Blau's laboratory, fue publicada en línea en Nature Cell Biology el 20 de abril.

Las células tuétano-derivadas del hueso se conocen como las células de vástago de la sangre, o células de vástago hematopoyético. Pueden dar lugar a toda la sangre y células inmunes en el cuerpo. Aunque han demostrado la progenie de estas células de vástago hematopoyético previamente al fusible con una variedad de la otra célula mecanografíada dentro el cuerpo, esta fusión ocurre tan infrecuentemente que había sido pensado para tener poca significación biológica.

Las neuronas de Purkinje son células grandes en una porción del cerebro conocido como el cerebelo, que está implicado en equilibrio control y del motor. Forman acoplamientos entre muchas otras neuronas, y no regeneran. Son la única célula en el cerebro demostrado por Blau y otros al fundirse con éstos las células tuétano-derivadas del hueso en ratones y seres humanos.

Los estudios anteriores que investigaban esta fusión de la célula en ratones confiaron en el uso de dosis mortales de la radiación al suprimir un sistema hematopoyético del ratón antes de introducir las células madre de la sangre dirigidas para expresar una proteína fluorescente verde. Las nuevas células de vástago de la sangre entonces enteramente repoblan el sistema hematopoyético ahora -ausente del animal con las células verde- que despedían luz fluorescente cuyo origen podría ser identificado fácilmente. Los investigadores podrían entonces seleccionar heterokaryons en el cerebro buscando las neuronas verdes contra un fondo neutral.

Los investigadores, en la colaboración con los científicos en la Universidad de Columbia Británica en Vancouver, utilizaron esta técnica en el estudio actual para trasplantar una sola célula madre hematopoyética y para probar que los heterokaryons en el cerebro fueron derivados de sangre. Sin embargo, porque tales altas dosis de radiación se saben que es analizada por la barrera natural que restringe el flujo de células y de moléculas entre el cerebro y la sangre, Blau y sus colegas preguntados si esta fusión inmóvil ocurriría bajo condiciones menos fisiológico traumáticas.

Utilizaron una técnica llamada parabiosis para introducir las células de sangre que expresaban la proteína fluorescente verde en un animal sin modificar. En parabiosis, dos ratones se ensamblan quirúrgicamente de una manera tal que compartan un sistema circulatorio. Un ratón había sido dirigido para expresar la proteína verde en todas sus células, y una no tenía. Porque los animales compartieron una fuente de la sangre por varias semanas, sobre la mitad de las células de sangre en el ratón sin modificar expresó el verde proteína, bastante para permitir a los investigadores detectar las células fundidas en el cerebro.

Los investigadores encontraron la evidencia de la fusión entre las células de sangre y las neuronas de Purkinje en este sistema radiación-libre 20 a 26 semanas después de la cirugía. En hecho, los heterokaryons verdes eran identificables para hasta 20 semanas después de que los ratones fueron separados, cuando la mayoría de las células de sangre en el ratón sin modificar habían sido regeneradas como células no-coloreadas.

Pero entonces Johansson vio algo sorprendente. Como en experimentos anteriores, la mayoría de los ratones tenían números muy bajos de células fundidas en sus cerebelos, pero algunos tenían más. Hasta 100 veces más.

"Clas ha conocido considerablemente más heterokaryons que nosotros conocimos en el pasado", dijo Blau, "menos de de 10 en un animal entero a varios cientos". Cuando los investigadores miraban más de cerca, encontraron que esos animales con números altos de células fundidas también tenían una condición inflamatoria de la piel común a los ratones del laboratorio del envejecimiento llamados dermatitis ulcerative idiopathic. Este tipo de inflamación crónica afecta el sistema inmune entero del animal y causa una inmunorespuesta en todo el sistema.

Los investigadores confirmaron que el aumento notable en los números de células fundidas fue relacionado con la inflamación usando el acercamiento tradicional del trasplante del tuétano de radiation/bone en ratones con dermatitis. Finalmente, contaron las células fundidas que formaron en un modelo de la esclerosis múltiple - una enfermedad autoinmune del ratón caracterizada por la inflamación y el daño del sistema nervioso central. El neurólogo y el especialista Lorenzo Steinman, MD, profesor de la esclerosis múltiple de la neurología y de las ciencias neurológicas en la escuela médica, fueron coautor de la investigación y con tal que el modelo del ratón para el estudio. Heterokaryons en algunos de estos ratones numeró en los millares.

Lo que cautivaba más que el aumento inflamación-inducido en números era un experimento cross-especies que demostró núcleos de las células de vástago de la sangre de la rata que se habían fundido a las células de Purkinje en la parada de los ratones que expresaba las proteínas de la célula de sangre y comienza a expresar productos neurona-específicos del gen de la rata. Este interruptor ejemplifica un tipo de genético reprogramando esto ha sido una fuente de la discusión en curso y del gran interés en el mundo de la investigación de la célula de vástago. Tal reprogramación es crítica a la regeneración de tejidos finos funcionales por las células de vástago.

"Qué estamos viendo somos que este fenómeno está sucediendo en la vida verdadera", dijo Blau, que los planes siguientes a estudiar si tales fusiones pueden rescatar las neuronas dañadas o que mueren de Purkinje, "no sabemos todavía si esta función es beneficiosa, pero ahora sabemos que hay los sitios en donde sucede en bastante los de alta frecuencia bajo ciertas condiciones, y que estos núcleos se pueden incluso reprogramar".

Los colegas de Stanford de Blau y de Steinman en la investigación incluyen Sawsan Youssef, PhD; Regis Doyonnas, PhD; Kassie Koleckar y Colin Holbrook; así como la Universidad de Stephane Corbel de Columbia Británica, PhD, y Fabio Rossi, MD, PhD.

La investigación fue financiada por la fundación de Wenner-Gren (Suecia), la fundación del af Jochnick (Suecia), la sociedad nacional de la esclerosis múltiple, los institutos nacionales de la salud, el instituto canadiense de la investigación de la salud, la fundación de McKnight y la fundación de Baxter.

New study may open new doors to Multiple Sclerosis cell-mediated gene therapy

After the fusion, the blood-cell nuclei begin to express previously silent, neuron-specific genes. The surprise finding in mice suggests that the creation of the fused cells, called heterokaryons, may possibly play a role in protecting neurons against damage and may open new doors to cell-mediated gene therapy.

"This finding was totally unprecedented and unexpected," said senior author Helen Blau, PhD, the Donald E. and Delia B. Baxter Professor and director of the Baxter Laboratory in Genetic Pharmacology. "We're getting hints that this might be biologically important, but we still have a lot to learn." The research, led by Clas Johansson, PhD, a postdoctoral scholar in Blau's laboratory, was published online in Nature Cell Biology on April 20.

The bone marrow-derived cells are known as blood stem cells, or hematopoietic stem cells. They can give rise to all the blood and immune cells in the body. Although the progeny of these hematopoietic stem cells have previously been shown to fuse with a variety of other cell types in the body, this fusion occurs so infrequently that it had been thought to have little biological significance.

Purkinje neurons are large cells in a portion of the brain known as the cerebellum, which is involved in balance and motor control. They form junctions between many other neurons, and they do not regenerate. They are the only cell in the brain shown by Blau and others to fuse with these bone marrow-derived cells in mice and humans.

Previous studies investigating this cell fusion in mice relied on the use of lethal doses of radiation to abolish one mouse's hematopoietic system prior to introducing blood stem cells engineered to express a green fluorescent protein. The new blood stem cells would then entirely repopulate the animal's now-absent hematopoietic system with green-fluorescing cells whose origin could be easily identified. The researchers could then pick out heterokaryons in the brain by looking for green neurons against a neutral background.

The researchers, in collaboration with scientists at the University of British Columbia in Vancouver, used this technique in the current study to transplant a single hematopoietic stem cell and prove that the heterokaryons in the brain were derived from blood. However, because such high doses of radiation are known to break down the natural barrier that restricts the flow of cells and molecules between the brain and the blood, Blau and her colleagues wondered if this fusion would still occur under less physiologically traumatic conditions.

They used a technique called parabiosis to introduce blood cells expressing green fluorescent protein into an unmodified animal. In parabiosis, two mice are surgically joined in such a way that they share a circulatory system. One mouse had been engineered to express the green protein in all its cells, and one had not. Because the animals shared a blood supply for several weeks, about half of the blood cells in the unmodified mouse expressed the green protein-enough to enable the researchers to detect fused cells in the brain.

The researchers found evidence of fusion between blood cells and Purkinje neurons in this radiation-free system 20 to 26 weeks after surgery. In fact, green heterokaryons were identifiable for up to 20 weeks after the mice were separated, when most of the blood cells in the unmodified mouse had been regenerated as non-colored cells.

But then Johansson saw something surprising. As in previous experiments, most of the mice had very low numbers of fused cells in their cerebellums, but a few had more. Up to 100 times more.

"Clas noted significantly more heterokaryons than we ever had in the past," said Blau, "from fewer than 10 in an entire animal to several hundred." When the researchers looked more closely, they found that those animals with higher-than-expected numbers of fused cells also had an inflammatory skin condition common to aging laboratory mice called idiopathic ulcerative dermatitis. This type of chronic inflammation affects the entire immune system of the animal and causes a systemwide immune response.

The researchers confirmed that the remarkable increase in the numbers of fused cells was related to inflammation by using the traditional radiation/bone marrow transplant approach in mice with dermatitis. Finally, they counted the fused cells that formed in a mouse model of multiple sclerosis - an autoimmune disease characterized by inflammation and damage of the central nervous system. Neurologist and multiple sclerosis specialist Lawrence Steinman, MD, professor of neurology and neurological sciences at the medical school, co-authored the research and provided the mouse model for study. Heterokaryons in some of these mice numbered in the thousands.

Even more intriguing than the inflammation-induced increase in numbers was a cross-species experiment that showed nuclei from rat blood stem cells that had fused to Purkinje cells in mice stop expressing blood cell proteins and begin to express rat neuron-specific gene products. This switch exemplifies a type of genetic reprogramming that has been a source of ongoing debate and great interest in the world of stem cell research. Such reprogramming is critical to the regeneration of functional tissues by stem cells.

"What we're seeing is that this phenomenon is happening in real life," said Blau, who next plans to study whether such fusions can rescue damaged or dying Purkinje neurons. "We don't know yet if this function is beneficial, but we now know that there are sites where it happens at fairly high frequencies under certain conditions, and that these nuclei can even be reprogrammed."

Blau's and Steinman's Stanford colleagues on the research include Sawsan Youssef, PhD; Regis Doyonnas, PhD; Kassie Koleckar and Colin Holbrook; as well as the University of British Columbia's Stephane Corbel, PhD, and Fabio Rossi, MD, PhD.

The research was funded by the Wenner-Gren Foundation (Sweden), the af Jochnick Foundation (Sweden), the National Multiple Sclerosis Society, the National Institutes of Health, the Canadian Institute of Health Research, the McKnight Foundation and the Baxter Foundation.

Source: Science daily © 1995-2008 ScienceDaily LLC (21/04/08)